山东国康真菌荧光染色液标准化操作流程（SOP）与注意事项

一、真菌荧光染色液标准化操作流程（SOP）

实验前准备

试剂与耗材：山东国康真菌荧光染色液（A液、B液或单一优化液）、载玻片、盖玻片、接种环、一次性吸管、荧光显微镜（配备UV或蓝光激发块，发射滤片420-470nm）。

样本类型：皮屑、甲屑、毛发、体液（痰液、尿液、胸水等）、组织匀浆。

环境要求：生物安全柜或洁净实验室，避免交叉污染；室温15-30℃，避光操作。

样本采集与处理

皮屑/甲屑：

消毒病变部位（75%乙醇），用钝刀刮取皮屑或甲屑，置于载玻片上。

滴加1-2滴10%-20% KOH溶液，覆盖盖玻片，静置5-10分钟（或轻微加热）使样本透明化。

体液/组织匀浆：

痰液、尿液等液体样本直接涂布于载玻片；血液或胸水需离心后取沉渣涂片。

自然晾干或火焰固定（避免高温破坏菌丝结构）。

真菌荧光染色液荧光染色步骤

滴加染色液：

在已处理的样本边缘滴加1-2滴A液，自然渗入盖玻片下；随后滴加B液（若为单一液则直接滴加）。

避免气泡产生，确保样本完全覆盖。

孵育：

室温避光孵育5-10分钟（根据试剂说明书调整时间），使染料与真菌充分结合。

封片与观察：

用封片剂封片（防止液体挥发），置于荧光显微镜下观察。

低倍镜（10×）扫描全片，定位可疑区域；高倍镜（40×）确认形态（菌丝、孢子、酵母样细胞）。

阳性结果：发出亮绿色或蓝绿色荧光；阴性结果：无特异性荧光。

真菌荧光染色液结果记录与报告

记录荧光强度、分布及形态特征，结合临床信息出具报告。

阳性样本需标注菌种推测（如皮肤癣菌、酵母菌等），必要时建议进一步检测（如PCR或质谱鉴定）。

二、真菌荧光染色液关键注意事项

安全与防护

避光保存：染色液需用棕色瓶或铝箔包裹，避免光淬灭。

个人防护：操作时佩戴手套、口罩，防止试剂接触皮肤或黏膜。

废弃物处理：按医疗废弃物规定处理使用后的耗材和试剂。

样本质量

厚度控制：皮屑、甲屑不宜过厚，否则影响KOH透明效果和染料渗透，可能导致假阴性。

新鲜度：优先采集病灶边缘的新鲜样本，避免陈旧或污染样本。

KOH处理：角质层厚的样本需充分透明化（可稍加热加速，但避免沸腾）。

染色控制

时间控制：孵育时间过短（荧光弱）或过长（背景着色深）均影响结果，需严格遵循试剂说明书。

封片必要性：封片可防止液体挥发，保持镜检图像清晰。

显微镜校准：确保荧光显微镜光源充足，滤光片组合正确；镜检前用阳性质控片验证系统。

干扰排除

假阳性：某些纤维（如棉花、纸纤维）可能产生非特异性荧光，需结合真菌形态（分隔、分枝、孢子形态）鉴别。

假阴性：样本处理不当（如KOH未充分透明）或染色液失效可能导致漏检，需设立阴性质控片监控。

结果解读

综合判断：荧光染色结果为病原学诊断依据之一，需结合患者症状、体征及其他检查结果（如培养、PCR）综合分析。

局限性：荧光染色无法替代真菌培养确定菌种，对疑难病例建议联合多模态检测（如荧光+PCR/质谱）。

三、真菌荧光染色液优势与适用场景

高灵敏度：可检测微量真菌（检测下限达10³ CFU/mL），适用于真菌血症等低载量感染的早期筛查。

快速高效：全程仅需2-5分钟，显著缩短镜检时间，提升工作效率。

操作简便：对检验人员技术要求低，基层医院也可开展。

广泛适用：真菌荧光染色液覆盖皮肤科、检验科、感染科、ICU等多科室，支持门诊快速筛查和急诊即时检测（POCT）。